1、分区设置

 

      临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区，如使用全自动分析仪，区域可适当合并。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。

      在理想情况下，PCR实验室试剂准备、标本制备、扩增三个区域可设置缓冲间。

·各工作区域完全相互独立；

·各工作区域之间无条件设置缓冲间；

·按各区域要求设置实验室压力；

·若各区紧密相连，需安装物品传递舱；

·人流、物流单一方向流动；

·各区仪器设备、清洁用具明确标记，不得混用；

·各区使用不同的实验服，实验服不得带出

·工作结束后立即清洁

2、各区功能及设置

 

2.1 试剂贮存和准备区

区域功能：

      所有试剂的配制与分装，主反应混合液的制备，试剂原材料和配制试剂的贮存。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。

            本区对与气流压力的控制，没有严格要求。

仪器设备：

超净工作台                                  高速离心机                                电子天平 

2～8℃和-20℃以下冰箱               混匀器                                      微量加样器（覆盖0.2-1000µl）

可移动紫外灯（近工作台面）       专用工作服和工作鞋                   专用办公用品

消耗品（一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头）

2.2 标本制备区

区域功能：

      临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 临床样本应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。具有潜在传染危险性的材料：必须在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序。

      本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。

仪器设备：

2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱        高速离心机                         混匀器

水浴箱或加热模块                            微量加样器                         可移动紫外灯

生物安全柜                                      专用工作服和工作鞋            专用办公用品

超声波水浴仪                                   消耗品（一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头）

2.3 扩增区

区域功能：

      该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

      本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。个别操作如加样等应在超净台内进行。

仪器设备：

荧光定量PCR仪                           PCR扩增仪                          超净工作台（生物安全柜）

低温、冷藏冰箱                           微量加样器                         可移动紫外灯

专用工作服和工作鞋                    专用办公用品                       消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头

2.4 扩增产物分析区

区域功能：

      该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。

      本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。

仪器设备：

      视检验方法不同而定。基本仪器设备如下：

微量加样器                                  微波炉                                 电泳仪

凝胶成像系统                               可移动紫外灯                      专用工作服和工作鞋

专用办公用品                               消耗品（一次性手套、加样器吸头）

3、工作人员操作要求

 

实验操作中                                                                                  实验结束后

一次性手套和帽子                                                                        立即进行清洁

正确使用加样器，避免产生气溶胶污染                                          实验室台面、超净台10%次氯酸钠溶液擦拭

实验材料散落或PCR产物外溅时，立即清洁处理并做记录                实验室空间定期紫外照射

                                                                                                   实验室和设备的使用必须有日常记录

4、试剂

 

等级                                   实验用水                                   试剂配置                                      质量控制

不含DNA和DNase             一级水                                    大体积配置，小体积分装。             关键试剂质量检测

的分析纯和生化试剂                                                          标注名称、浓度、配置者、

                                                                                         保存条件、失效时间

5、防止污染

 

      PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。

      严格分区：工作服；实验用具；实验记录本

      样品管理：包装完好；明确标识；避免交叉污染

      扩增产物：PCR反应液加UDG酶；dUTP代替dTTP

      RNase：玻璃器皿和溶液经DEPC处理；实验起始阶段使用RNase抑制剂；实验操作在冰浴中进行。

      污染后处理：环境污染源检测；材料散落、产物外溅立即清洁并记录

6、安全防护

 

      放射线：依据GB11930-2010操作非密封源的辐射防护

      紫外线：防护目镜和面罩

      溴化乙锭：一次性腈类手套、固定区域与容器

      细菌培养物：培养物及其平皿121℃、30min消毒后丢弃

7、废弃物处理

 

      吸头：使用过必须放入专门的消毒容器（含10%的次氯酸钠溶液）内浸泡不少于24h；污染PCR产物必须放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧

      废液：含有PCR产物的任何废液必须收集至1 mol/L HCl中，浸泡时间不少于6h,并且不能在实验室内倾倒，而应当至远离PCR实验室的地方弃掉

      含EB：含有EB或经过EB浸泡的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液净化处理

      阳性样品：GB/T 19495.1-2004

      阳性质粒：1mol/LHCl浸泡不少于6h